4. Bowser
Menjadi antagonis utama di film, Bowser (Jack Black) nyatanya punya sisi lembut dan manis yang membuat penonton akan mengetahui alasannya berbuat jahat. Raja para Koopa ini mencuri "super star" dan merencanakan untuk menaklukkan Kerajaan Jamur.
5. Donkey Kong
Donkey Kong (Seth Rogen) adalah gorila antropomorfik yang kuat, sekaligus pewaris takhta Kerajaan Hutan. Dalam film, Donkey Kong digambarkan sebagai anak dari King Cranky Kong (Fred Armisen). Mario harus berhadapan dengan Donkey Kong di sebuah arena pertandingan untuk sebuah misi khusus.
Selain para tokoh itu, penonton juga akan mendapati banyak karakter menarik sepanjang durasi. Ada keluarga besar Mario dan Luigi, penyihir Koopa bernama Kamek yang jadi penasihat Bowser, Raja Penguin dan rakyatnya, serta bintang kecil Lumalee yang menggemaskan sekaligus meresahkan dengan ucapan-ucapan sarkastiknya.